細胞懸浮培養(yǎng)是利用生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞生產生物制品的核心技術，是當前國際上生物制品生產的主流模式，其最大優(yōu)勢是通過更為精確有效的工藝控制手段，在獲得最大產量的同時能穩(wěn)步提高產品的質量。但該技術目前在國內尚未得到廣泛應用，生物制品生產仍主要采用病毒產率低、生產成本高、勞動強度大的轉瓶細胞培養(yǎng)方式。隨著現(xiàn)代生物技術發(fā)展，利用細胞懸浮培養(yǎng)技術進行生物制品生產是生物制藥行業(yè)發(fā)展的必然趨勢。
1、懸浮培養(yǎng)技術在生物制藥中的應用歷史和現(xiàn)狀
1962年，Capstick等率先對BHK21細胞馴化實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)，并用于獸用疫苗生產。1967年，Van Wezel又開發(fā)了微載體并實現(xiàn)在生物反應器中大規(guī)模培養(yǎng)貼壁細胞。到20世紀80年代，CHO細胞實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)，治療性抗體生產技術的發(fā)展極大地推動著生物反應器在生物制藥行業(yè)中的應用，到20世紀末已進入萬升級規(guī)模。2000年以后，隨著流加培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)、個性化細胞培養(yǎng)基等技術的發(fā)展，作為大規(guī)模培養(yǎng)主要設備的生物反應器規(guī)模也趨向大型化和簡單化。現(xiàn)在，全球10000L及以上體積的反應器達一百多臺，最大已達25000L，且?guī)缀醵际强梢苑糯蟮臋C械攪拌式反應器，主要為Genetech、Amgen、BoehringerIngelheim 和Lonza等公司所擁有。2007年全球銷售額最高的6大類生物技術藥物中，有5類是經哺乳動物細胞表達生產的。縱觀國內，人用和獸用疫苗生產企業(yè)已超過110家，應用反應器懸浮培養(yǎng)技術生產疫苗的僅4家。一般獸用疫苗企業(yè)采用國內自主開發(fā)的650 L和1200 L反應器生產口蹄疫疫苗。
2、懸浮培養(yǎng)工藝中的關鍵技術
懸浮培養(yǎng)技術主要包括高表達細胞株的獲得、個性化培養(yǎng)基的研發(fā)、動物細胞反應器及配套設施的完善及生產工藝的優(yōu)化等四個方面。
2.1 細胞與毒株的馴化
為提高生物制品的產率和安全有效性，在生物反應器中繁殖的病毒與細胞需要進行相互適應選擇，針對不同的毒株及其表達量篩選適合的宿主細胞對于細胞大規(guī)模生產具有重要意義。
為實現(xiàn)馴化的穩(wěn)定，通常由高密度細胞培養(yǎng)轉向低密度細胞培養(yǎng)，由高濃度血清培養(yǎng)逐漸降低血清濃度進行培養(yǎng)。細胞馴化時應該注意保持細胞活力應90%以上，測定細胞增殖能力的和表達分泌能力進行，避免馴化后的細胞表達特性發(fā)生變化。馴化后細胞的增殖能力、活力及生產能力要能夠滿足工業(yè)大規(guī)模生產的需要。由于特定細胞的營養(yǎng)需求不同，實現(xiàn)其馴化的難易程度也不同，在馴化時需要選用合適的細胞培養(yǎng)基，有針對性地補充某些營養(yǎng)成分以滿足細胞的特定需求，使馴化好的細胞可以保持其懸浮或是無血清生長的特性。
2.2 細胞培養(yǎng)基的個性化
在大規(guī)模培養(yǎng)技術中，維持細胞高密度甚至無血清生長，細胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)含量對細胞的增殖、維持至關重要。在懸浮培養(yǎng)技術中，不同細胞營養(yǎng)代謝的特異性不同，細胞和病毒培養(yǎng)工藝不同，需要抗剪切力、滿足放大功能，還需要提高目標生物制品的穩(wěn)定性、表達量，這些均需要個性化培養(yǎng)基的支持。我國銷售的細胞培養(yǎng)基卻多為20世紀50年代發(fā)明的MEM、DMEM、199、RPMI1640細胞培養(yǎng)基等，這些目錄產品難以滿足生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的技術要求，直接影響了生物制藥行業(yè)技術升級。從對人類和動物安全性的長遠考慮，生物制品生產越來越傾向采用無血清無動物組分培養(yǎng)基，因為無血清培養(yǎng)基杜絕了血清的外源性污染和對細胞毒性作用，使產品易于純化、回收率高，國際上生物制藥生產中，已經有50%以上采用無血清細胞培養(yǎng)基。
2.3 細胞培養(yǎng)工藝的研發(fā)
懸浮培養(yǎng)過程技術的開發(fā)和應用主要是生產工藝的開發(fā)和工藝過程優(yōu)化，維持細胞生長和病毒繁殖的最優(yōu)化環(huán)境控制，在懸浮培養(yǎng)技術中的作用同樣至關重要。
2.3.1懸浮培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)
懸浮培養(yǎng)技術按細胞貼壁性分為懸浮細胞培養(yǎng)和貼壁細胞微載體懸浮培養(yǎng)。懸浮細胞可以在反應器中直接生產增殖，細胞自由生長、培養(yǎng)環(huán)境均一、取樣簡單、培養(yǎng)操作簡單可控、放大方便、污染率和成本低;而貼壁細胞在反應器中懸浮培養(yǎng)需要借助微載體，細胞和球體接觸部位營養(yǎng)環(huán)境較差，培養(yǎng)、取樣觀察及放大工藝復雜，成本高。
雖然相對于懸浮培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)復雜，但與轉瓶培養(yǎng)相比仍有很大優(yōu)勢，能提高生產規(guī)模、產品質量和勞動效率，因此是貼壁細胞懸浮培養(yǎng)的主要手段。常見的微載體有實體的Cytodex微載體、片狀的DISK微載體及多孔的Cytopore微載體。使用DISK或Cytopore時細胞貼附于載體內部生長，表面細胞較少，難以使用細胞消化等方法將載體和細胞進行分離，且反應器放大工藝困難，不適合非釋放病毒的培養(yǎng)。而Cytodex比較適應罐倒罐的反應器放大工藝，目前報道的貼壁細胞生產工藝的最佳形式是機械攪拌式反應器實體微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，可實現(xiàn)最有效的優(yōu)化工藝和最適宜的工藝設計，其最佳工藝設計體現(xiàn)于高密度連續(xù)灌流培養(yǎng)。
2.3.2懸浮培養(yǎng)方式
選擇反應器懸浮培養(yǎng)方式需要考慮細胞和病毒的關系、產物穩(wěn)定性、細胞培養(yǎng)基或添加物的選擇、細胞培養(yǎng)規(guī)模等幾個因素。按照培養(yǎng)方式分為批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)及灌注培養(yǎng)。
批培養(yǎng)能直觀反映細胞在生物反應器中的生長、代謝變化，操作簡單，但初期代謝廢產物較多，抑制細胞生長，細胞生長密度不高;流加培養(yǎng)操作簡單、產率高、容易放大，應用廣泛，但需要進行流加培養(yǎng)基的設計;灌注培養(yǎng)的培養(yǎng)體積小，回收體積大，產品在罐內停留時間短，可及時回收到低溫下保存，利于保持產品的活性，但操作比較繁雜、細胞培養(yǎng)基利用效率低、旋轉過濾器容易堵塞等。不同的病毒采用的培養(yǎng)方式不同，如對于分泌型且產品活性降低較快的生物制品，宜采用灌注培養(yǎng)，且灌注培養(yǎng)也更適宜于微載體培養(yǎng)。同一生物制品由于其營養(yǎng)環(huán)境的不同，其生產工藝也可能發(fā)生變化，如BHK21細胞生產口蹄疫病毒，低血清培養(yǎng)時采用批培養(yǎng)，接毒前需要更換無血清的維持液;而無血清培養(yǎng)過程中無需換液，配合流加培養(yǎng)可能效果更好。
3、細胞懸浮培養(yǎng)在畜禽疫苗中的應用
目前疫苗免疫是控制動物傳染病的重要措施之一。怎樣提高疫苗質量，降低疫苗成本已成為各大動物疫苗生產企業(yè)關注的焦點。工業(yè)化細胞培養(yǎng)生產疫苗是提高疫苗質量，降低成本的有效手段。
3. 1 豬病毒病疫苗
狂犬病毒在2 L的生物反應器繁殖，病毒最大滴度能夠達到1.38×108pfu/ mL，且生產的疫苗質量達到WHO要求。無血清微載體細胞培養(yǎng)有利于腸炎病毒繁殖和疫苗生產。同樣有不少關于細胞培養(yǎng)大規(guī)模生產豬偽狂犬、豬藍耳病、豬口蹄疫、豬瘟、豬細小病毒病等疾病疫苗的報道。
3. 2 禽病毒病疫苗
禽類疫苗主要通過SPF雞胚生產，但雞胚生產疫苗需要消耗大量SPF雞胚，生產周期長，易污染，且每枚SPF雞胚一次只能注射一個病毒毒株。因此，SPF雞胚生產疫苗的效率很低。我國已經能夠通過細胞培養(yǎng)生產出符合《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》的雞傳支H120細胞弱毒苗。楊濤等也報道了禽流感病毒在MDCK細胞中大規(guī)模增殖規(guī)律。國外有不少關于細胞培養(yǎng)生產禽馬立克病毒、傳染性法氏囊病、傳染性喉氣管炎、產蛋下降綜合征病等疾病疫苗的報道。
4 展望
應該認識到，快速實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)技術在疫苗生產中的應用只是搭建了一個升級工藝的平臺，而不是最終目的，行業(yè)和企業(yè)發(fā)展真正的動力是新獸藥、新疫苗、新工藝以及配套技術的創(chuàng)新。
例如無血清培養(yǎng)基的開發(fā)和無血清培養(yǎng)病毒生產技術的開發(fā);利用合適的培養(yǎng)基和轉染或馴化技術實現(xiàn)貼壁細胞的懸浮培養(yǎng)構建;新宿主細胞表達品種開發(fā)，例如同一種產品采用新的宿主細胞表達或是開發(fā)一種高效表達的宿主細胞適應幾種產品的表達等。總而言之，整合行業(yè)力量，快速實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)技術在疫苗生產中的升級換代是未來幾年我國生物制藥行業(yè)發(fā)展的重點。這個過程應重視成熟技術、成功率，減少和避免時間、資金、人力等資源的浪費，減少機會成本，搶占市場先機。懸浮培養(yǎng)技術的升級將導致行業(yè)整合與重組，生物制藥行業(yè)將出現(xiàn)明顯的集約化趨勢，有實力的企業(yè)將不斷以創(chuàng)新新藥、新技術研發(fā)為基礎和核心競爭力，同時借助資金實力整合制造和營銷體系，成為真正意義上的龍頭。
來源：中國獸用生物制品